Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Chromatografia cienkowarstwowa – relikt przeszłości czy nowoczesna technika analityczna?
Chromatografia cienkowarstwowa – relikt przeszłości czy nowoczesna technika analityczna?

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) funkcjonuje zarówno jako proste narzędzie laboratoryjne wymagające niewielkiego oprzyrządowania, jak i wyrafinowana, w pełni zinstrumentalizowana technika analityczna. Istota procesu rozdzielania w TLC opiera się na separacji składników mieszanin naniesionych na specjalnie przygotowane płytki chromatograficzne pokryte fazą stacjonarną. Choć historia tej techniki analitycznej sięga początku XX w., nadal jest to kluczowe narzędzie w laboratorium, a wdrożone modyfikacje i ulepszenia prowadzą do zwiększenia jej skuteczności i obszaru zastosowania.

 

Chromatografia cienkowarstwowa na przestrzeni lat

Za początek rozwoju technik chromatograficznych uznaje się rok 1903, kiedy Mikhail Tsvet po raz pierwszy dokonał rozdziału barwników organicznych na kolumnie wypełnionej kredą. Pierwsze udokumentowane użycie cienkiej warstwy adsorbentu do separacji składników mieszanin miało miejsce w 1938 r. Dokonało tego dwóch naukowców: N.A. Izmailov oraz M.S. Schreiber. Oddzielili oni ekstrakty roślinne na adsorbencie o grubości 2 mm. W kolejnych latach inni badacze potwierdzili skuteczność tej techniki, uzyskując podobne rezultaty. Zaczęto wprowadzać pierwsze udoskonalenia, w tym m.in. dodatek środków wiążących do sorbentów. W latach 40. XX w. starano się znormalizować cały proces. Dzięki temu TLC zyskało na popularności. Opracowano oprzyrządowanie umożliwiające precyzyjne nakładanie próbek na płytki oraz ilościową ocenę oddzielonych plam. Ulepszenia zaowocowały większą mocą separacji i szybszą analizą. Kolejny przełom nastąpił w latach 60. XX w., kiedy to płytki do TLC stały się dostępne komercyjnie. Opublikowano wówczas pierwszy podręcznik laboratoryjny na temat TLC, opracowano także pierwsze przyrządy do densytometrii. W latach 70. XX w. chromatografia cienkowarstwowa straciła na znaczeniu z powodu szybkiego rozwoju metod separacji kolumnowej. O ponownym wzroście zainteresowania w ostatnich latach zdecydowały wprowadzone zmiany aparaturowe, instrumentalizacja, a co za tym idzie – zwiększenie zdolności rozdzielczych.

Obecne osiągnięcia i zastosowanie

Obecnie chromatografia cienkowarstwowa uznawana jest za szybką, tanią i elastyczną technikę separacji stosowaną w podejściu jakościowym i ilościowym. Uzyskanie wyników o wysokiej jakości wiąże się jednak z koniecznością instrumentalizacji całego procesu. Z tego powodu najczęściej wykorzystywaną odmianą TLC jest wysokosprawna technika HPTLC. W porównaniu do klasycznego TLC do techniki wysokosprawnej wprowadzono szereg modyfikacji zwiększających jej wydajność i skuteczność. Przede wszystkim charakterystyczne w HPTLC jest stosowanie mniejszych płytek, złoża z przeciętną wielkością ziaren od 5 do 15 μm oraz objętości próbki zwykle nieprzekraczającej 0,2 μl. Co ważne, jest to technika szybka. Czas rozwijania chromatogramu w HPTLC zwykle trwa od 3 do 6 minut. Ważnymi cechami współczesnej HPTLC jest również wykorzystanie oprzyrządowania do półautomatycznego nanoszenia próbek, rozwoju chromatogramów, derywatyzacji, dokładnej i precyzyjnej rejestracji in situ oraz kwantyfikacji chromatogramów. Wprowadzane modyfikacje tej techniki głównie opierają się na nowych rozwiązaniach aparaturowych, ale także skuteczniejszych metodach detekcji. Współczesna TLC (szczególnie HPTLC) jest dobrym uzupełnieniem np. metod spektroskopowych.

Aktualnie chromatografia cienkowarstwowa znajduje zastosowanie w szeregu rozwiązań, m.in. analizie leków, ekstraktów ziołowych, suplementów diety, próbek biologicznych, żywności, zanieczyszczeń środowiska i wielu innych. Wykorzystywana jest:

* do wstępnego badania próbek mającego na celu zidentyfikowanie, które z nich wymagają szczegółowej analizy (możliwa obecność pożądanego analitu tylko w niewielkiej liczbie próbek),

* w przypadku, gdy badany materiał ma złożoną matrycę, utrudniającą lub wręcz uniemożliwiającą zastosowanie innych technik analitycznych; TLC/HPTLC jest stosowana także, gdy nie są znane właściwości matrycy,

* do frakcjonowania klasowego, czyli identyfikacji analitów według przynależności do określonej grupy chemicznej,

* do szybkiej analizy dużej ilości próbek,

* do wstępnego oczyszczania próbek, które następnie mogą być poddane dalszej procedurze analitycznej,

* do sprawdzania, w jaki sposób przebiega dana reakcja chemiczna lub czy zakończyła się.

Kierunki rozwoju chromatografii cienkowarstwowej

Wraz z kolejnymi badaniami i rozwojem naukowym wyznaczane są nowe możliwości stosowania chromatografii cienkowarstwowej. Rozwój tej techniki dotyczy głównie aparatury, w tym płytek do TLC, adapterów i densytometrów. Rosnąca ilość związków chemicznych analizowanych z wykorzystaniem TLC powoduje, że zachodzi potrzeba doskonalenia lub opracowywania nowych metod detekcji (metody barwnej oraz instrumentalnej detekcji analitów). Jednym z kierunków rozwoju TLC jest umożliwienie jak najskuteczniejszego analizowania substancji bezpośrednio z płytki pokrytej sorbentem. Wprowadzane są także nowe rozwiązania metodologiczne w TLC, np. nadciśnieniowa TLC (OP-TLC), gdzie zachodzi tzw. pompowanie eluentu wzdłuż płytki lub dwuwymiarowa, gradientowa chromatografia cienkowarstwowa (MGD-2D-TLC).

Jednym z nowych trendów rozwoju tej techniki, który zasługuje na szczególną uwagę, jest połączenie TLC ze spektrometrią mas. Szczególne znaczenie ma połączenie TLC-MALDI, które daje szerokie możliwości identyfikacji składników złożonych mieszanin, zwłaszcza małych cząsteczek oraz szanse opracowania nowatorskich podejść metodologicznych, w tym nowych faz stacjonarnych dla TLC, które mogą być odpowiednie do bezpośredniego wykrywania za pomocą spektrometrii mas (na rynek wprowadzane są już pierwsze tego typu rozwiązania). Mimo że MALDI może być połączone z szeregiem innych technik, np. elektroforezą, stworzenie połączenia hybrydowego z TLC daje szereg korzyści, np. możliwość bezpośredniego wprowadzania płytki pod źródło jonów. W tym celu opracowano specjalne adaptery oraz systemy umożliwiające bezpośrednią analizę. Dostępne są płytki o wysokiej czystości sorbentu, które umożliwiają analizy śladowe, na poziomie nanogramów. Te i inne rozwiązania powodują, że procedura analityczna z wykorzystaniem TLC-MALDI staje się znacznie szybsza i skuteczniejsza.

Źródła

1. Wilson, I.D.; Poole, C.F. Planar chromatography - Current practice and future prospects. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2023, 1214, 123553, doi:10.1016/j.jchromb.2022.123553.

2. Makuch, B. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA. 2004, 174-191.

3. Matysik, E.; Woźniak, A.; Paduch, R.; Rejdak, R.; Polak, B.; Donica, H. The New TLC Method for Separation and Determination of Multicomponent Mixtures of Plant Extracts. J. Anal. Methods Chem. 2016, 2016, doi:10.1155/2016/1813581.

4. Ahmad Dar, A.; Sangwan, P.L.; Kumar, A. Chromatography: An important tool for drug discovery. J. Sep. Sci. 2020, 43, 105–119, doi:10.1002/jssc.201900656.

5. Borisov, R.; Kanateva, A.; Zhilyaev, D. Recent Advances in Combinations of TLC With MALDI and Other Desorption/Ionization Mass-Spectrometry Techniques. Front. Chem. 2021, 9, 1-12, doi:10.3389/fchem.2021.771801.

6. Wang, M.; Zhang, Y.; Wang, R.; Wang, Z.; Yang, B.; Kuang, H. An Evolving Technology That Integrates Classical Methods Chromatography Bioautography. Multidiscip. Digit. Publ. Inst. 2021, 26, 121.

Fot. Płytka TLC – chromatogram, Wydział Chemii UWr. Autor: Daniel Dróżdż praca własna, licencja: CC BY 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=84144362

Fot. bestbox: Oryginalnym przesyłającym był Natrij z angielskiej Wikipedii. Na Commons przeniesiono z en. Wikipedii., CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=514759

KOMENTARZE
news

<Marzec 2024>

pnwtśrczptsbnd
26
27
29
1
2
3
4
6
8
9
10
11
12
16
17
18
20
22
23
24
25
28
29
30
31
Newsletter