W celu oszacowania początkowej ilości DNA w próbie kluczowe jest wyznaczenie punktu Cq, zwanego cyklem kwantyfikacji, czyli momentu, w którym reakcja wchodzi w fazę logarytmicznego przyrostu produktu i poziom fluorescencji umożliwia wiarygodny odczyt. Im większa ilość wyjściowego materiału, tym wcześniej zostaje osiągnięty punkt Cq. Porównanie jego wartości z Cq próby o znanym stężeniu DNA pozwala na oszacowanie liczby cząsteczek w próbie badanej.
Jako detektory stosować można barwniki niespecyficzne, wiążące się z każdym rodzajem dwuniciowego DNA, jak np. SYBR Green. Ich zaletą są dużo niższe koszty i łatwość zaplanowania reakcji, jednak stosowanie takich barwników wiąże się z wyższym ryzykiem błędów i wyników fałszywie dodatnich. Bardziej czułe są natomiast barwniki specyficzne, jak np. sondy TaqMan, będące krótkimi oligonukleotydami z dołączonym znacznikiem fluorescencyjnym na jednym końcu i wygaszaczem na drugim, komplementarne do fragmentu wydłużanej sekwencji. Podczas działania polimerazy sonda, specyficznie związana z wydłużaną sekwencją, ulega degradacji. Fizyczne oddzielenie fluorochromu od wygaszacza umożliwia emisję fluorescencji.
Wszelkie modyfikacje metod wykorzystujących technikę qRT-PCR zależne są jedynie od intencji badacza i rodzaju próby, którą chce poddać analizie, a polegają one jedynie na dobraniu odpowiednich reagentów i warunków reakcji. Ilościowa PCR wymaga natomiast zastosowania termocyklera połączonego ze spektrofluorymetrem, który umożliwia pomiar widma podczas trwania reakcji. Termocyklery takie stosować można zarówno dla amplifikacji DNA, jak i RNA (w tym przypadku do oceny ilościowej wymagane jest zastosowanie enzymu – odwrotnej transkryptazy). Na rynku pojawia się coraz więcej urządzeń tego typu, które dopasowywane są do istotnych wymagań użytkowników: niewielkie wymiary, przepustowość czy integracja oprogramowania. Wyposażone są one w różnego rodzaju platformy, w których umieszcza się bezpośrednio probówki z badanym roztworem. Wystarczy umieścić je w termocyklerze i zasiąść wygodnie przed ekranem komputera, na którym wyświetlą się widma pozwalające śledzić przebieg reakcji, krok po kroku – w czasie rzeczywistym.
Magdalena Sokulska
