Technika „touch – down” PCR polega na zmianie temperatury przyłączania starterów podczas kolejnych cyklów reakcji. Początkowo przewyższając temperaturę topnienia starterów, temperatura przyłączania spada wraz z każdym cyklem, aż stanie się niższa od punktu topnienia. Dzięki temu reakcja przechodzi przez punkt optymalny, zapewniając specyficzne przyłączenie starterów do ich prawidłowej, docelowej sekwencji, zanim nastąpi przyłączanie nieswoiste. Stosując touch – down PCR, omija się potrzebę determinowania optymalnej temperatury przyłączania dla każdej pary primerów. Zwykle dzięki tej metodzie można uzyskać duże ilości produktu.
Nawet przykuwając wiele uwagi projektowaniu starterów i określaniu właściwych warunków ich przyłączania do matrycy, może się pojawić wiele problemów związanych ze specyficznością, i to przed rozpoczęciem pierwszego cyklu PCR. Dlaczego tak się dzieje ? Otóż zwykle wszystkie komponenty reakcyjne dodawane są do probówki na lodzie bądź w temperaturze pokojowej, a kolejno umieszczane są w termocyklerze. Zanim jednak zostaną przeniesione do urządzenia, przez pewien czas przebywają w niższej temperaturze niż pokojowa lub równej. Zanim środowisko reakcyjne osiągnie około 65oC, może zachodzić niespecyficzne przyłączanie startera do matrycy, a nawet parowanie primerów między sobą. Wówczas takie konstrukty stają się substratami dla polimerazy DNA, co nieuchronnie prowadzi do powstawania niespecyficznych produktów oraz dimerów starterów. Jak tego uniknąć ?
Najwłaściwszym rozwiązaniem wydaje się być w tej sytuacji zastosowanie techniki „hot – start”. Jej zasada polega na fizycznym rozdzieleniu reagentów, zanim zostanie osiągnięta wyższa temperatura. Jeden ze sposobów to użycie termostabilnej polimerazy sprzężonej z przeciwciałem inaktywującym. Kiedy temperatura reakcji wzrośnie do 70oC, przeciwciało inhibitujące enzym denaturuje. Jednocześnie polimeraza aktywuje się, tym samym zapoczątkowując reakcję PCR. Jedyną wadą tej metody jest wysoki koszt polimeraz typu „hot – start”. Alternatywę stanowi użycie kulki woskowej. Po odpipetowaniu do probówki dNTP, buforu, DNA i MgCl2, dodaje się taką kulkę, a następnie podgrzewa, aż wosk stopnieje. Utworzy on warstwę nad składnikami reakcji. Potem ochładza się w celu zastygnięcia wosku. Wówczas dodaje się polimerazy DNA. Dzięki wcześniej utworzonej barierze woskowej, nie ma ona styczności z pozostałymi reagentami i nie ma możliwości inicjacji reakcji, zanim właściwa temperatura zostanie osiągnięta.
Booster PCR na służbie u śledczych
Czasami w kryminalistyce badacze mają do czynienia wręcz z śladowymi ilościami matrycy DNA. Przez to oddziaływanie pomiędzy nią a primerami zachodzi z niską częstotliwością. Co więcej, startery są wówczas skłonne do interakcji między sobą, co prowadzi do powstawania ich dimerów. Żeby temu zapobiec, można posłużyć się techniką „booster PCR”. W pierwszych kilku cyklach reakcji należy zapewnić bardzo małe stężenia primerów – około 10 nM. Dopiero po wstępnej amplifikacji zwiększa się stężenie primerów do typowego, wynoszącego ok. 0,2 µM. Metodę tę stosuje się także w przypadkach, kiedy prawdopodobieństwo parowania się ze sobą starterów jest wysokie (ze względu na charakter sekwencji nukleotydowych).
Czasami w wyniku reakcji łańcuchowej polimerazy powstaje szereg produktów nieswoistych. „Nested PCR” (lub PCR zlokalizowany, zagnieżdżony) to narzędzie pozwalające na „wyłowienie” tych właściwych produktów z „morza” niespecyficznych. Po 10 – 20 cyklach używa się nowego zestawu primerów, tzw. zagnieżdżonych. Przyłączają się one do miejsc znajdujących się wewnątrz fragmentu zamplifikowanego przez poprzednią parę starterów. W konsekwencji przeprowadzenia tych dwóch reakcji, uzyskuje się krótszy produkt.
Przydatne dodatki
Planując reakcję PCR, warto pamiętać o szeregu dostępnych dodatków, które pozytywnie wpływają na jej przebieg. Przykładowo, DMSO poprawia wydajność amplifikacji regionów bogatych w guaninę i cytozynę. Chaperony stabilizują jednoniciowy DNA i uniemożliwiają zwinięcie do postaci dwuniciowej, co uniemożliwiałoby przyłączenie starterów. Detergenty niejonowe stabilizują polimerazę Taq. Chlorek trimetyloamonowy (TMC) zapobiega niespecyficznemu przyłączaniu się primerów. Swoistość reakcji zwiększa się przez dodanie formamidu. Betaina, podobnie jak glicerol, redukuje tworzenie struktur drugorzędowych przez rejony bogate w guaninę i cytozynę oraz poprawia wydajność ich amplifikacji. W identyczny sposób działa 7 – deaza – dGTP. Surowicza albumina wołowa (bovine serum albumin, BSA) zaś staje się pomocna w amplifikacji starych próbek DNA lub matryc zanieczyszczonych inhibitorami.
Podsumowując, należy podkreślić, że projektowanie warunków reakcji PCR jest wieloaspektowe i analiza wszystkich czynników mających na nią wpływ pozwoli zauważyć potencjalne problemy. Niektóre z nich da się przezwyciężyć, stosując wymienione techniki optymalizacyjne.
Magdalena Małachowska
Źródła:
McPherson M. J., Moller S. G. (2006) PCR, The Basics. Taylor & Francis Group
J. Sambrook i D.W. Russel (2001) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
